聚合酶链式反应(聚合酶链式反应(PCR)技术原理)

2020-04-03 16:57  阅读 819 次

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多聚酶链反应(PCR)的发展,大力地推动了现代医学由细胞水平向分子水平、基因水平的发展。由于PCR技术具有快速、简便、特异、敏感等优点,使该技术广泛应用于临床诊断、医学遗传学、微生物学等生命科学的各个领域。PCR技术作为一项临床实验诊断方法,为临床疾病的诊断提供更加准确的依据。本文介绍了PCR技术的基本原理,总结了目前国内外的PCR的主要技术发展和类别。
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PCR的定义
PCR(polymerase chain reaction),即聚合酶链式反应,这是一种用于在体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,通过高温变性、低温复性和延伸这三个阶段不断循环,将特异片段的基因进行大幅扩增,从而达到将微量的DNA大幅增加的目的,以此来检测是否有特定基因存在的目的。
PCR的基本工作原理
DNA在体外95℃的高温时会变性,从双链解旋变成单链,为下轮反应做准备:在低温(经常是60℃左右)时,引物与解开的两条单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至72℃,在DNA聚合酶的作用下,以dNTP为原料、靶序列为模版,按照碱基互补配对原则和半保留复制原理,沿着磷酸到五碳糖(5‘-3’)的方向合成一条新的与模版DNA链互补的半保留复制链。
Mg2+浓度对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增;而浓度过低会降低TaqDNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。
缓冲液能够提供PCR 反应稳定环境,提高反应体系的抗干扰能力。引物和探针是扩增效率的关键。
内标控制系统,内标基因通常是选取与靶基因无相关性的序列设计引物探针,可在VIC/HEX 通道检测荧光。通过利用全自动荧光PCR 检测仪检测上述荧光信号,可以用来检测反应体系是否正常。
三代PCR技术
第一代PCR技术:
通常我们所说第一代PCR技术就是最初的PCR,采用普通PCR扩增仪来对靶基因进行扩增,然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析,通过比对条带的位置做出判断,只能做定性分析。最初的PCR技术所采用的核酸染料,会对实验人员和环境造成伤害,而且检测耗费时间较长,操作麻烦,容易出错,而且最后的结果只能做出定性的判断。
其原理是DNA在碱性的溶液中带有负电荷,因此,在电场作用下朝正极移动。在琼脂凝胶中电泳时,由于琼脂糖凝胶具有一定孔径,长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用不同,因此导致长度不同的DNA分子的迁移的速度不同,从而可以按照分子量大小得到有效分离。
第二代PCR称为实时荧光定量PCR技术:
通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积来实现实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
扩增曲线图:
横坐标:扩增循环数;
纵坐标:荧光强度
每个循环后都进行一次荧光信号的收集
可以看到PCR的扩增曲线呈现一个S形的曲线
目前qPCR常用荧光标记方法分为两种:一种是非特异性荧光标记:SYBR Green I,另外一种是特异性荧光标记:TaqMan
SYBR Green I法的方法原理是:当扩增时,单链开始扩展延伸,延伸结束,形成双链DNA,SYBR Green将结合到双螺旋小沟中,当受到适合光源激发,发射出荧光,反映产物浓度。
TaqMan作用机理是:
每扩增一条DNA分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光。
当探针完整,5′端荧光物质R受3′端淬灭物质Q的制约,不能检出荧光,而当扩展延伸时,由于与目标序列互补与展开的单链结合,R与Q分开,荧光物质此时则游离出来,荧光信号可以被检出。
第三代PCR技术:
第三代PCR称为数字PCR,目前分为微阵列芯片式PCR、液滴数字PCR,数字PCR一般包括两部分内容,即PCR扩增和荧光信号分析。
在PCR扩增阶段,与传统技术不同,数字PCR一般需要将样品稀释到单分子水平,并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法,数字PCR技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。最后通过直接计数或者泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或者含量。
微流控芯片数字PCR能够快速并准确地将样品流体分成若干个独立的单元,是进行多步平行反应、成本低、体积小和高通量,是理想的数字PCR平台。通过芯片设计将纳升液体封闭在高通量的微池或微量通道中进行后续的PCR扩增及扩增后结果的荧光显微镜进行直接判读。
液滴数字PCR则是将两种互不相溶的液体,以其中一种作为连续相(油项),另一种作为分散相(水项),在水/油两项表面张力和剪切力共同作用下分散相以微小体积单元的形式分散于连续相中,形成液滴,常用作微反应器,具有体积小、样品间无扩散,反应条件稳定等特点。
利用微滴发生器可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴,作为数字PCR的样品分散载体。液滴中包裹了单拷贝DNA模板和PCR反应液,将液滴收集在PCR反应管中进行扩增。PCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。
数字PCR通过稀释分离使每个反应室含一套扩增体系消除了本底信号的影响,因此检测结果具有很强特异性和灵敏性,并且通过稀释分离成几千至几百万个独立反应单元,再直接计数有扩增产物的个数,可以检测出极微量的核算模板量,理论上可以检测出单个拷贝的模板量。
PCR机器的基本构造
目前市面上宠物市场主流产品是第二代PCR,即荧光定量PCR,其基本的工作原理就是对扩增后的产物进行荧光物质的检测
荧光物质的发光的原理:
通过机器内部发射出短波长的激发光来激发荧光分子,荧光分子受到激发光的照射,会从下部的基态转变到上部的激发态,激发态的荧光分子就会向外辐射出波长较长的光,通过对荧光分子向外辐射的光进行检测,就能够对产物进行定量检测分析。
目前市面上主流的荧光定量PCR仪器主要构成分为三部分:扩增模块(温控系统),荧光检测模块(光学系统和检测系统)和数据分析模块(软件系统)
机器内部光源发出的光通过滤光片筛选出需要的激发波长,然后通过光斑整形照射到样本上,然后样本激发出荧光,然后再通过另外一块滤光片筛选出真正的荧光信号,入射到光电探测器上,通过光电探测器实现荧光信号的转换,转换出的电信号再进入到数据分析模块进行分析。
温控系统:
目前市面用的比较多的是半导体系统,还有一种是空气热循环
光学系统:光源:目前市面上主要的是四种,卤钨灯(发热量大寿命短),单色LED(窄光谱),白光LED(宽光谱),激光器(成本高)
探测系统:光电倍增管,光电二极管(逐点扫描),成像相机(同时扫描)
总结
PCR是一种用于在体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,通过高温变性、低温复性和延伸这三个阶段不断循环,从而达到将特异片段的基因进行大幅扩增的目的。
目前PCR技术已经发展到第三代数字PCR,第一代PCR为琼脂凝胶电泳法,第二代为荧光定量PCR,也是目前宠物市场上的主流PCR。
实时荧光定量PCR仪器是通过在PCR反应体系中加入荧光基团,通过利用荧光信号累积来实现实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线和CT值对未知模板进行定量分析的方法。
目前市面上主流的荧光定量PCR仪器主要构成分为三部分:扩增模块(温控系统),荧光检测模块(光学系统和检测系统)和数据分析模块(软件系统)
扩增模块通过精准控制温度的升高和降低,使核酸分子不断的循环高温变性、低温复性和延伸这三个阶段,从而使得特异的基因片段不断得进行半保留复制,荧光检测模块则是通过机器内部光源发出的光,通过滤光片发射出的激发波长照射到样本上,使荧光分子从基态变为激发态,从而激发出波长较长的光,激发的光入射到光电探测器上,通过光电控制器实现荧光信号到电信号的转换,转换出的电信号再进入到数据分析模块进行定量分析,通过软件分析出扩增曲线,CT值来进行最后结果的判断。

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